1.什么是杂交瘤测序
杂交瘤细胞抗体基因测序是指使用专业的兼并引物设计（degenerate primer）和测序方案，同时优化经济成本和时间成本，为客户提供快速准确的抗体可变区域以及全长基因测序服务。
图1：杂交瘤测序
2.杂交瘤测序目的
杂交瘤细胞在保存过程中存在抗体基因丢失、细胞状态不好影响抗体产生，甚至细胞死亡的情况，为将优秀抗体长期保存、稳定生产，可将杂交瘤细胞中的抗体基因提取并测序，最终拿到核苷酸序列，并以 dna 形式保存，用于后期外源表达及生产。3.杂交瘤测序应用杂交瘤细胞抗体测序所获取的杂交瘤细胞单克隆抗体基因序列，是发表文章和重组表达工程抗体的前提之一，同时也是抗体人源化工作的基础。
4.泰克生物能够为客户提供高质量的杂交瘤测序服务
标准周期单克隆抗体测序服务：抗体可变区vh和vl测序、抗体vh，vl和前导区测序、全抗体vh，vl，前导区和恒定区测序，3-4周完成测序服务。
快速单克隆抗体测序服务：从目标细胞株快速识别的抗体序列，可在10天内获得测序结果。
5.泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务的全流程介绍
泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务，流程包括：rna提取，cdna克隆，t载体构建，抗体基因测序，生物信息学分析，项目报告。
图2：杂交瘤测序流程
5.1杂交瘤生产和总rna提取根据制造商的说明，使用trizol试剂从杂交瘤细胞中提取总rna。5.2反转录合成抗体可变区cdna5.2.1反转录
使用逆转录酶试剂盒，另外使用的是rna样本（来自小鼠抗体的杂交瘤rna样本或来自嵌合抗体rna样本）、引物、10 mm脱氧核苷酸三磷酸混合物（dntps)、h2o和80u/μlrnase抑制剂。注意：由于其rna含量，将模板转换寡核苷酸分装并储存在–80℃。
根据以下方案执行逆转录：在操作期间将所有反应保持在冰上。对于每个rna样品，设置三个cdna合成反应：一个用于kappa链，一个用于lambda链，一个用于重链。理想情况下，每个抗体只会扩增一条轻链。
图3：3h4 kappa 和 3h4 lambda 可变区的蛋白质序列比较
5.2.1.1 在pcr管中，准备mix 1：2μl 50ng/μl rna、1μl 10μm基于抗体链的反向rt引物（例如用于小鼠抗体的migkrt、miglrt或mighgrt）和1μl 10mm dntp。对于一个rna样本，需要三管mix1，每管包含不同的反向引物。
5.2.1.2 在0.5ml eppendorf管中，配制mix 2：1.95μl h2o、2μl 5x smartscribe缓冲液、1μl 20mm dtt和0.3μl 100μm模板转换寡核苷酸。为mix2提供的体积用于一个cdna合成反应，因此根据需要进行放大，即每个杂交瘤rna样品制备mix 2体积的三倍。为所有反应准备了mix 2的一种主混合物。
5.2.1.3 通过在热循环仪中将含有mix 1的试管在72℃下孵育3分钟，使rna二级结构变性。
5.2.1.4在mix 1变性期间，将以下物质添加到mix 2：每个cdna合成反应0.25μl 80u/μl rnase抑制剂和0.5μl 100u/μl smartscribe逆转录酶。
5.2.1.5 将6μl mix 2添加到每管变性mix 1中。
5.2.1.6在热循环仪中，合并的混合物在42℃下孵育60分钟，然后在70℃下孵育5分钟终止反应。反应保持在4℃。逆转录后立即进行pcr扩增。不需要cdna纯化步骤。
5.2.2 抗体可变区的pcr扩增5.2.2.1为每个cdna合成设置pcr反应：10μl 5x pcr缓冲液，1μl 10mm dntps，3μl rt反应合成的cdna，2.5μl 10μm通用正向引物ispcr，2.5μl 10μm反向pcr引物在抗体链上（例如小鼠抗体的migkpcr、miglpcr或mighgpcr）、30.5μl h2o和0.5μl 2u/μl phusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。
5.2.2.2根据以下热循环仪条件进行降压/降压pcr：98℃ 30秒；98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒（每个循环降低温度0.5℃）和72℃ 30秒的10个循环；98℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒15个循环；随后72℃ 7分钟；并保持在4℃。
5.2.2.3每个rt-pcr反应取5μl在90v的tae缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上运行。扩增的小鼠抗体产物出现在550-600个碱基对之间。扩增的人抗体产物出现在750-850个碱基对之间。quick load purple 2-log dna ladder(neb,n0550s)用作标准品。
图4：抗体可变区pcr扩增
5.3 t载体构建
使用macherey-nagel的pcr清理和凝胶提取试剂盒对rt-pcr反应进行pcr清理。根据平末端克隆试剂盒手册，将2μl的每个pcr清洗的产物平末端克隆到pcr-blunt-ii-topo载体中。接下来，将每个topo克隆反应的3μl转化为化学感受态e.coli。将每个转化的100μl涂布在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上，并在37℃下孵育过夜。
5.4 抗体基因测序
获得菌落后，将每条抗体链5-10个菌落接种在5ml lb/卡那霉素培养基中，并在37℃下以250rpm摇动过夜。这些培养物使用macherey-nagel的小量制备试剂盒进行小量制备，所得质粒dna由sequetech corporation使用m13正向引物进行sanger测序。
5.5生物信息学分析
使用 github 上提供的自定义 python 程序分析测序数据，去除非功能性的dna。
5.6项目报告
交付得到的抗体序列。
杂交瘤细胞单抗基因序列的获取是进行重组抗体制备，抗体药开发的基础。泰克生物能够准确熟练地对多物种来源的杂交瘤细胞进行序列测定，服务包括小鼠杂交瘤细胞，大鼠杂交瘤细胞，兔杂交瘤细胞以及不同物种的重组单克隆抗体（通过噬菌体技术构建的单抗基因获得）等。通过严格的质量控制，以确保高准确度。